Исследование

Стильбазольные аналоги ресвератрола и их регуляторное влияние на митоходриальное дыхание как основа цитопротекторного/цитостатического эффектов


Тип исследования
Фундаментальное
Грантодающая организация
РФФИ, правительство Республики Мордовия
Номер проекта (по данным грантодающей организации)
18-43-130004 р_а
Срок реализации
2018 - 2020
Финансирование по годам
2018 1 000 000,00 ₽
Всего 1 000 000,00 ₽

Исполнители:


Проект предусматривает разработку новых цитопротекторов/цитостатиков и включает следующие этапы: направленный синтез стильбазольных аналогов ресвератрола, исследование их физико-химических свойств, биоскрининг (цитопротекторная активность, цитотоксичность). Целью проекта является молекулярное конструирование новых стильбазольных аналогов ресвератрола и исследование их анти/прооксидантного эффекта и механизма влияния на митохондриальную дыхательную цепь. Общий принцип конструирования базируется на биоизостерной замене одного из бензольных колец в молекуле ресвератрола на пиридиновый фрагмент, а также на варьировании количества и положения гидроксильных (метоксильных) групп в скелете молекулы. Такая замена призвана совершенствовать структуру ресвератрола как фенольного антиоксиданта путем создания гибридной структуры, способной ингибировать радикально-цепные процессы по различным механизмам, повышая антиоксидантную активность за счет синергического сочетания антирадикальной активности фенольных фрагментов с противопероксидной активностью пиридинового атома азота. Дополнительное введение электронодонорных (гидроксильных, метоксильных) групп приводит к увеличению реакционной способности гибридной молекулы по отношению к свободным радикалам. Присутствие в структуре пиридинового атом азота (за счет способности к солеобразованию) также позволяет устранить существенный недостаток ресвератрола – его низкую биодоступность при пероральном применении, обусловленную в том числе плохой водорастворимостью. Кроме того, алкилирование азота приводит к образованию катионного центра – вектора для доставки соединений в митохондрии, а способность исследуемых веществ к рН-зависимой флуоресценции представляет интерес для визуализации митохондрий и измерения их мембранного потенциала. В качестве методов для комплексного изучения физико-химических свойств и биологической активности новых соединений будут использованы ИК, УФ, флуоресцентная и ЯМР спектроскопия, МТТ тест, ДФПГ тест, исследование митохондриального дыхания, флуоресцентная микроскопия. Результатом исследований будет являться установление общих закономерностей влияния структуры стильбазольных аналогов ресвератрола на их физико-химические свойства и физиологическую активность, что, в свою очередь, является основой создания кандидатов в лекарственные препараты.

Powered by Froala Editor



Семенов А.В.

Отчет за 1 квартал ( по состоянию на 1 апреля 2019 года)

Ранее нами сообщалось о синтезе гидроксистильбазолов (1а-д) [DOI: 10.1007/s00044-018-2150-8] – аналогов природного антиоксиданта ресвератрола – и исследовании их антирадикальных свойств. Продолжая изучение данных соединений как потенциальных антиоксидантов (АО), мы провели электрохимические исследования, а также изучили кинетику взаимодействия этилолеата (ЭО) с кислородом в присутствии соединений (1а-д).

Таблица 1

Соединение

R

H

4-OH

3,5 – (OH)2

3,4 – (OH)2

3,4,5-(OH)3


Электрохимическое исследование соединений

Известно, что для некоторых веществ существует корреляция между потенциалами окисления антиоксидантов и их антирадикальной способностью. В целом полагается, что чем легче происходит электрохимическое окисление соединения, тем эффективнее должны быть его антиоксидантные свойства. Электрохимические измерения проводились методом циклической вольтамперометрии (ЦВА) в трехэлектродной электрохимической ячейке. В качестве рабочего электрода использовали стержень из стеклоуглерода, электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, противоэлектродом служила платиновая проволока. 

Для более точной оценки потенциала окисления соединения () был применен метод дифференциальной инверсионной вольтамперометрии.

Анализ вольтамперограмм свидетельствует о том, что в условиях эксперимента все рассматриваемые образцы подвергаются необратимому окислению. Исходя из полученных зависимостей, были определены потенциалы окисления исследуемых соединений (см. таблицу 2). 


Таблица 2 – Потенциалы окисления исследуемых веществ и соединений сравнения

Соединение

Ионол

ЕOx, В

1.27

1.09

0.77

0.96

0.75

0.60


На качественном уровне полученные величины окислительных потенциалов позволяют предполагать высокую антиоксидантную активность веществ (), () и (), поскольку из литературы известно, что наиболее эффективные антиоксиданты имеют величины потенциалов окисления в интервале 0.6–0.8 В. Следует отметить, что экстремально низкий первый потенциал окисления соединения (1д) заставляет рассматривать возможность взаимодействия данного гидроксистильбазола непосредственно с кислородом воздуха. 


Исследование антиоксидантной активности соединений кинетическими методами

Одним из широко применяемых способов оценки антиоксидантной активности является кинетический метод, основанный на волюмометрическом измерении концентрации поглощенного кислорода. В качестве модельных систем в таком методе обычно выступают растворы метилолеата, стирола или этилбензола в инертных неполярных растворителях (обычно хлорбензоле), а инициирование процесса происходит за счет генерирования первичных радикалов при термическом разложении АИБН. 

У данного варианта имеется ряд существенных недостатков. Во-первых, изучаемые системы очень сильно отличаются от биологических систем, а во-вторых, при исследовании антиоксидантной активности полифенольных структур в таких условиях возникает проблема с их растворимостью. Исходя из этого, в нашем исследовании мы использовали иную водно-липидную модельную систему, во многом лишенную указанных недостатков.

Антиоксидантную активность в водно-липидной среде изучали волюмометрическим методом в установке типа Варбурга. Субстратом окисления выступал этилолеат в присутствии триметилцетиламмоний бромида в качестве ПАВ и раствора хлорида меди (II) в качестве катализатора. Процесс окисления проводили при t = (60±0,2) °С. 

Полученные кинетические кривые поглощения кислорода представлены на рисунке 


Графическим методом определяли величину периода индукции (τi), представляющую собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром из точки пересечения касательных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяли совокупностью реакций ингибитора и обозначали как антиоксидантную активность, количественно рассчитанную по формуле

АОА=где τS – период индукции окисления субстрата в отсутствие АО, τi – период индукции окисления в присутствии исследуемого АО.


Из наклона кинетических кривых определяли начальную (Wнач) и максимальную (Wmax) скорости окисления липидного субстрата с добавками антиоксидантов. Полученные параметры приведены в таблице 3. 


Таблица 3 – Кинетические параметры окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии исследуемых соединений (1×10-3 М) и 2×10-3 М хлорида меди (II), t = 60°С

Соединение

Линия тренда

начального 

участка КК

Wнач×107,

М×с-1

Линия тренда

конечного 

участка КК

Wmax×107, М×с-1

WmaxO)/ Wmax (AO)

τi,

мин

АОА

ЭО

y = 0.028x+0.1608

R² = 0.9924

3.13

y = 0.0361x-0.6218

R² = 0.9990

4.03

1.00

24

ресвератрол

y = 0.0025x-0.0109

R² = 0.8943

0.28

y = 0.035x-7.5752

R² = 0.9979

3.91

1.03

304

11.7

y = 0.0165x + 0.2902

R² = 0.9948

1.84

y = 0.0336x + 3.1483

R² = 0.9980

3.75

1.07

200

7.3

y = 0.0076x+0.2259

R² = 0.9928

0.85

y = 0.0299x-5.4554

R² = 0.9974

3.34

1.21

275

10.5

y = 0.0234x-0.0924

R² = 0.9938

2.61

y = 0.0282x-0.6729

R² = 0.9990

3.15

1.28

57

1.4

y = 0.0163x-0.0704

R² = 0.9952

1.82

y = 0.0297x-1.9367

R² = 0.9974

3.31

1.22

135

4.6

y = 0.0139x + 0.2756

R² = 0.9555

1.55

y = 0.0348x – 1.5038

R² = 0.9968

3.38

1.19

93

2.9


Следует отметить, что эффективность и механизм действия антиоксидантов качественно можно оценить уже по характеру кинетических кривых. 

Анализ данных показывает, что в водно-липидной среде ресвератрол проявляет себя как сильный ингибитор. На его кинетической кривой наблюдаются периоды полного торможения, аутоускорения и этап достижения максимальной скорости, сравнимой с Wmax для контрольного субстрата.

Для других анализируемых веществ наблюдается более сложный характер действия в исследуемой системе. В этих случаях кинетические кривые имеют аутоускоренный характер без периода полного торможения. Такой характер КК для соединений () – (), возможно, связан с частичным подавлением антиоксидантных свойств фенольного гидроксила за счет образования хелатных комплексов с катионами меди (II). Тем не менее, все соединения замедляли процесс окисления, увеличивая периоды индукции окисления модельного субстрата, а также снижая как начальную, так и максимальную скорости окисления.

Для соединений () – () особо следует отметить значимое снижение (в 1,2 – 1,3 раза) максимальной скорости окисления, которая так и не достигала величины, полученной при неингибированном окислении модельного субстрата. Вероятным объяснением данного явления является способность субстратов () – () не только взаимодействовать с пероксильными радикалами, но и (за счет наличия атома азота в системе) разрушать гидропероксиды молекулярным путем, что кинетически может проявляться в снижении начальной (Wнач.) и максимальной (Wмах.) скоростей окисления этилолеата.

Powered by Froala Editor